SEJARAH PEWARNAAN GRAM

Ketika bekerja dengan jaringan paru-paru yang terinfeksi dari mayat, ahli patologi Denmark menemukan sebuah teknik yang luar biasa yang yang masih digunakan secara umum hingga lebih dari 100 tahun kemudian. Bagaimana ini bisa terjadi?
Hans Christian Gram (lahir tahun 1853) belajar botani di University of Copenhagen di Denmark. Studi tentang tanaman memperkenalkannya kepada dasar farmakologi dan penggunaan mikroskop.

Pada tahun 1883, ia lulus dari sekolah kedokteran dan setelah merantau di seluruh Eropa, ia menetap di Berlin. Pekerjaan awal nya bersangkutan studi sel darah merah manusia. Dia adalah orang yang pertama yang mengakui bahwa makrosit merupakan karakteristik anemia pernisiosa.

Pada tahun 1884, sambil memeriksa jaringan paru-paru dari pasien yang meninggal karena pneumonia, Gram telah menemukan bahwa noda yang istimewa diambil dan disimpan oleh sel bakteri. Pada langkah pertama, ia dikeringkan cairan smear pada kaca preparat di atas api kompor dan menuangkan larutan Gentian (kristal) violet di atasnya. Setelah dibilas dengan air, ditambahkan larutan Lugol – larutan triiodida kalium yang bertindak sebagai mordant untuk memperbaiki pewarnaan. Lalu ia menuangkan etanol lebih dari slide untuk membasuh pewarna. Bakteri tertentu (pneumokokus) mempertahankan warna (gram positif), sementara spesies lain menjadi hilang warnanya dengan alkohol (gram negatif). Pekerjaan awal dengan proses pewarnaan ini dilakukan pada Streptococcus pneumoniae dan Klebsiella pneumoniae.

Gram adalah seorang manusia sederhana, dan dalam publikasi awal ia berkomentar, "Karena itu saya telah menerbitkan metode, meskipun saya sadar bahwa belum sempurna, sangat cacat dan tidak sempurna, tetapi metode tersebut diharapkan akan berubah menjadi berguna di tangan peneliti lainnya nanti. "

Gram tidak menggunakan counterstain dalam prosedur nya. Beberapa tahun kemudian, bahwa ahli patologi Jerman Carl Weigert (1845-1904) dari Frankfurt, menambahkan langkah terakhir dari pewarnaan dengan safranin. Gram dahulu tidak pernah menggunakan counterstaining merah untuk memvisualisasikan bakteri gram negatif.

Pada tahun 1891, Gram menjadi dosen di farmakologi, dan kemudian tahun itu diangkat sebagai profesor di Universitas Copenhagen. Pada tahun 1900 ia mengundurkan diri Kursi di Farmakologi menjadi Profesor Kedokteran. Raja Denmark memberikannya penghargaan Dannebrog Komandan pada tahun 1912, dan Golden Medal of Merit pada tahun 1924. Dia pensiun pada tahun 1923 dan meninggal pada tahun 1938.

Teknik pewarnaan yang  ia kembangkan masih merupakan metode yang paling penting untuk membedakan antara dua kelas utama dari bakteri. Penemuannya pada tahun 1884 terjadi selama tahun-tahun keemasan mikrobiologi klinis. Waktu itu saat piring Petri  diciptakan (1887), Agar ditemukan (1881), dan Pasteur dan Koch berada di puncak kinerjanya, dan penemuan agen etiologi dari banyak penyakit yang ganas dan menjengkelkan dari saat itu.

Terlepas dari kesederhanaan dan keraguan keberhasilannya, teknik ini, Gram Stain, terus menjadi prosedur standar untuk klasifikasi bakteri di mikrobiologi medis hingga saat ini.

MEKANISME PEWARNAAN GRAM

Apa yang membuat beberapa sel mempertahankan warna cristal violet (Gram positif) sementara yang lain siap melepaskan pewarnaan ketika alkohol (saat dekolorisasi) ditambahkan pada spesimen (Gram negatif)?

Bakteri gram positif memiliki lapisan seperti dinding sel tebal yang terbuat dari peptidoglikan (50-90% dari dinding sel) yang akan memperlihatkan noda/pewarnaan berwarna ungu. Gram-negatif memiliki lapisan tipis (10% dari dinding sel) yang akan memperlihatkan pewarnaan berwarna merah muda. Bakteri gram negatif juga memiliki membran luar tambahan yang berisi lipid dan dipisahkan dari dinding sel oleh ruang periplasmik.

Ada empat langkah dasar pada pewarnaan Gram, meliputi menerapkan noda primer (crystal violet) untuk mengikat dengan panas dari kultur bakteri, diikuti oleh penambahan (Gram Iodin), dekolorisasi cepat dengan alkohol atau aseton, dan counterstaining dengan safranin atau fuchsin. 

Crystal violet (CV) memisah dalam larutan air ke dalam ion CV + dan klorida (Cl -). ion ini menembus dinding sel dan sel membran dari kedua sel gram baik Gram-positif maupun Gram-negatif.

Ion CV+ berinteraksi dengan komponen bermuatan negatif dari sel bakteri dan noda sel ungu. Yodium (I - atau i3 -) berinteraksi dengan ion CV+ dan membentuk kompleks besar kristal violet dan iodine (CV - I) pada lapisan dalam dan luar sel.

Ketika dekolorisasi menggunakan alkohol atau aseton, agen dekolorisasi tersebut berinteraksi dengan lipid yang terdapat pada membran sel. Sebuah sel Gram-negatif akan kehilangan membran luar dan lapisan peptidoglikan yang dibiarkan terbuka.

CV- Iodine kompleks tercuci dari sel Gram-negatif bersama dengan membran luar. Sebaliknya, sel Gram-positif menjadi terdehidrasi dari penambahan etanol. CV-Iodine yang banyak dan kompleks terperangkap dalam sel Gram-positif karena sifat berlapis-lapis peptidoglikannya. Jadilah sampel preparat gram-positif berwarna ungu sedangkan gram-negatif berawana merah.

Langkah dekolorisasi sangat penting dan harus diperhitungkan waktunya dengan benar. Pewarnaan kristal violet akan terhapus dari sel kedua Gram-positif dan negatif jika agen dekolorisasi dibiarkan terlalu lama (dekolorisasi biasanya hanya dalam hitungan detik saja).

Setelah dekolorisasi, sel Gram-positif tetap ungu dan sel Gram-negatif kehilangan warna ungunya. Counterstain, yang biasanya bermuatan positif seperti safranin atau fuchsin, diterapkan terakhir untuk memberikan bakteri Gram-negatif yang telah didekolorisasi menampilkan warna merah muda atau merah.

SEBUAH METODE YANG "TIDAK SEMPURNA"

Beberapa bakteri, setelah pewarnaan dengan pewarnaan Gram, menghasilkan pola Gram-variabel: campuran sel merah muda dan ungu terlihat.

The Actinomyces genera, Arthobacter, Corynebacterium, Mycobacterium, dan Propionibacterium memiliki dinding sel sangat sensitif terhadap kerusakan selama pembelahan sel yang dapat berdampak terhadap hasil pewarnaan Gram-negatif sel Gram-positif ini. Pewarnaan organisme tersebut menghasilkan penampilan yang tidak rata atau granular.

Pada kultur Bacillus Gram-positif, Butyrivibrio, dan Clostridium, terjadi penurunan ketebalan peptidoglikan selama pertumbuhan. Untuk alasan ini, organisme ini sangat rentan terhadap dekolorisasi yang berlebihan pada pembilasan menggunakan aseton-alkohol, dan ini harus dilakukan secara hati-hati.

Selain itu, untuk semua bakteri yang menggunakan pewarnaan Gram, usia kultur dapat mempengaruhi hasil dari pewarnaan seperti yang terlihat dalam pada gambar di atas.

sumber: Jay Hardy, CLS, SM (ASCP) Santa Maria. CA